https://virgool.ir/feed/@dr_khosravimعضو هیئت علمی دانشگاه شهید چمران اهواز - PhD Immunology; Tehran University - مدیرعامل شرکت آریا آزمای آویساfa2026-11-12 13:29:35https://files.virgool.ir/upload/users/92132/avatar/avatar.pnghttps://virgool.ir/@dr_khosravimhttps://virgool.ir/@dr_khosravim/نانوذرات-ایمونومگنت-h9cox7vra4gbآنچه باید درباره­ی روش جداسازی مغناطیسی (Immunomagnetic Separation) و نانوذرات ایمونومگنت (Immunomagnetic Beads) بدانیم:مقدّمه:تعریف کلّی: در روش جداسازی مغناطیسی (Immunomagnetic Separation) به کمک نیروی مغناطیس نانوذرات آهن میکروارگانیسم هدف از سایر میکروارگانیسم‌های غیرهدف و اجزای مهارکننده نمونه جدا می‌شود و سلول‌های هدف در حجم کمتری تمرکز می‌یابند.تاریخچه: روش جداسازی مغناطیسی یک روش ساده اما قدرتمند برای جداسازی میکروارگانیسم موردنظر از سوسپانسیون­های ناهمگن است، مانند مواردی که در غذا، نمونه­های بالینی و مدفوع با آنها مواجه می­شویم. برای نخستین بار در ابتدای دهه­ی 1900 میلادی Johne و همکارانش از این روش برای جداسازی پاتوژن­های باکتریایی از نمونه­های شیر بهره بردند. پس از آن Cudjoe و همکارانش و همچنینOlsvik و همکاران، از این روش برای جداسازی باکتری­های پاتوژن از نمونه­های غذایی استفاده کردند. در ادامه، این روش در نمونه­های مختلف بالینی و غذایی توسط Muramatsu و همکاران،Skjerve و همکاران وی مورد استفاده قرارگرفته و موفق نیز بوده است. برای نخستین بار در سال 1998 روش جداسازی مغناطیسی توسط Grant برای جداسازی باکتری مایکوباکتریوم اویوم تحت­گونه­ی پاراتوبرکلوزیس از نمونه­ی شیر شرح داده شد. از این روش برای جداسازی پاتوژن­های هدف از مایع مغزی نخاعی و مدفوع بیماران مبتلا به ایدز نیز استفاده شده است.روش جداسازی مغناطیسی؛ چرایی و چگونگی:فلسفه­ی پیدایش روش جداسازی مغناطیسی: روش جداسازی مغناطیسی در کنار دیگر روش­های تشخیصی، برای ردیابی ارگانیسم­های بیماری­زا به کار گرفته می­شود. روش­های تشخیصی مختلف برای شناسایی میکروارگانیسم­های موردنظر حائز نقاط ضعفی هستند. برای روشن شدن بیشتر موضوع به توضیح مختصری درباره­ی دیگر روش­ها می­پردازیم:روش کشت باکتریایی: این روش در عین حال که در زمینه شناسایی بسیاری از عوامل بیماری­زا به عنوان روش استاندارد طلایی برگزیده شده است اما؛ در معرض آلودگی با سایر پاتوژن­های غیرهدف است. برای باکتری­های کند رشد و نیازمند به پالایش شیمیایی روش کشت بسیار زمان­بر بوده و دارای مراحل پیچیده و پرزحمت است و نیز احتمال آسیب به سلول­های هدف حین پالایش شیمیایی دائما چالش­برانگیز می­باشد. حساسیت این روش برای برخی پاتوژن­ها در نمونه­های بالینی با غلظت­های پایین پاتوژن هدف ضعیف گزارش شده است.روش PCR: این روش برای تشخیص میکروارگانیسم­های بیماری­زا سریع و دارای حساسیت بالا می­باشد اما؛ هر نمونه­ی بالینی یا مواد غذایی حائز اجزای پروتئینی و ترکیباتی هستند که از آن­ها به عنوان مهارکننده­های روش PCR یاد می­شود و موجب کاهش چشمگیری در حساسیت این روش می­شود.روش الایزا: برای تشخیص آلودگی و غربالگری، سرم بهترین نمونه و الایزا مطمئن‌ترین، سریع‌ترین و ساده‌ترین روش است اما؛ حساسیت آزمایشات مبتنی بر الایزا برای برخی پاتوژن­ها ضعیف و نتایج آن همواره محل بحث می­باشد.با توجه به تمامی این نقصان­ها در سایر روش­های تشخیصی، روش جداسازی مغناطیسی به وجود آمده تا به کمک خاصیت مغناطیسی نانوذرات آهن میکروارگانیسم هدف را از سایر میکروارگانیسم‌های غیرهدف و اجزای مهارکننده نمونه جدا کند و سلول‌های هدف را در حجم کمتری متمرکز سازد. به‌ طور خلاصه، مزیت روش جداسازی مغناطیسی این است که خاصیت ویژگی تحلیلی و حساسیت روش تشخیصی بعدی را به میزان چشمگیری افزایش می­دهد.در نتیجه ابداع روش جداسازی مغناطیسی و تولید نانوذرات ایمونومگنت برای نیل به دو هدف کلی صورت گرفته است:1) افزايش حساسيت روش­هاي تشخيصي: جهت انجام آزمون­هاي تشخيصي به صورت تصادفي قسمت اندكي از نمونه مورد آزمون انتخاب و بررسي مي­شود؛ در شرايط ميزان اندك و يا پراكنش ناهمگون هدف در زمينه مورد بررسي احتمال منفي كاذب شدن نتيجه آزمايش افزايش مي­يابد. نانوذرات ايمونومگنت با تخليص چند هزار برابري هدف در حجم مورد بررسي منجر به افزايش چشم­گير حساسيت آزمون­هاي تشخيصي خواهد شد.2) تخليص و جداسازي هدف مدنظر از زمينه­هاي مختلف: نمونه­هاي مورد ارزيابي در آزمايش­هاي مختلف اغلب در بردارنده تركيبات مخل آزمون است؛ لذا جداسازي عامل مد نظر منجر به رفع اين نقص خواهد شد. نانوذرات ايمونومگنت جداسازي هدف از زمينه­هاي مختلف از قبيل نمونه­هاي خون، شير، مدفوع، ادرار، آب و خاك را امكان­پذير مي­نمايند.ساختار و روش کار نانوذرات ایمونومگنت:در روش جداسازی مغناطیسی برای ایجاد نوعی واکنش حساس بین نانوذرات مغناطیسی و پاتوژن هدف، سطح نانوذرات مغناطیسی معمولا با مولکول‌های تشخیصی‌زیستی مانند آنتی‌بادی، آپتامر، بیوپروتئین و یا کربوهیدرات پوشانده می­شود؛ که امکان تشخیص و هدف‌گیری میکروارگانیسم موردنظر را فراهم می‌سازد. روش جداسازی مغناطیسی متکی بر برهم‌کنش بین آنتی‌ژن‌های سطح سلولی پاتوژن هدف و مولکول‌های تشخیصی‌زیستی متصل­شده به نانوذرات پارامغناطیس است. به عنوان مثال اگر آنتی‌بادی‌های مناسب بر علیه آنتی‌ژن‌های سطحی پاتوژن X تولید یا بهینه شود، می­توان به وسیله­ی روش جداسازی مغناطیسی این ارگانیسم را به صورت انتخابی از نمونه‌های بالینی و مواد غذایی جداسازی و تغلیظ نمود، بنابراین ویژگی و حساسیت روش‌های تشخیصی بعدی بهبود می‌یابد.سیر تکاملی نانوذرات ایمونومگنت:روش جداسازی مغناطیسی نیز همانند سایر روش­های شناسایی میکروارگانیسم­ها دارای نقاط ضعف مشخصی است؛ که در سیر تکامل این به رفع این نواقص پرداخته شده است. مهم­ترین نقطه ضعف روش جداسازی مغناطیسی اتصال غیراختصاصی است. دو نوع اتصال غیراختصاصی برای نانوذرات ایمونومگنت توصیف کرده­اند. اولین نوع مشاهده شده، زمانی­ست که نانوذرات پارامغناطیس بدون پوشش استفاده می­شده و درصد اتصال پاتوژن­های غیرهدف کمتر از % 11 بوده است. این امر ناشی از اتصال غیراختصاصی سطحی نانوذرات پارامغناطیس و میکروارگانیسم­های غیرهدف است که احتمالا به دلیل پیوندهای الکترواستاتیک یا نیروهای واندروالسی می­باشد. نوع دوم اتصال غیر اختصاصی که بیش از % 11 رخ می­دهد، ناشی از واکنش متقابل بین لیگاند پوششی (پپتید یا آنتی­بادی) و معمولا پاتوژن­هایی رخ می­دهد که ارتباط نزدیک با هدف دارند اما خود هدف نیستند. چالش­های مربوط به اتصال غیراختصاصی به ایمونومگنت­ها را می­توان در سیر تکاملی این روش، با پوشش نانوذرات پارامغناطیس با لیگاندهای خاص حل کرد.در ابتدای ابداع روش جداسازی مغناطیسی از آنتی­بادی پلی­کلونال به عنوان ملکول­ زیستی­-تشخیصی برای پوشاندن سطح نانوذرات آهن استفاده شد؛ اما به دلیل بروز مشکل اتصال غیراختصاصی پس از مدتی به آنتی­بادی­های منوکلونال و سپس به ملکول­های زیستی دیگری مانند پپتیدها روی آورده شد. به کار بردن لیگاندهای تشخیصی اختصاصی­تر برای پوشاندن روی سطح نانوذرات مغناطیس موجب بالاتر رفتن هزینه­ی سنتز نانوذرات ایمونومگنت نیز می­شد؛ که خود عاملی مهم در دور کردن این محصول کارآمد بیولوژیک از بازار تجاری بود.به روزترین روش­ها در سنتز نانوذرات ایمونومگنت از پپتیدهای مشتق شده به روش بیوپنینگ به عنوان ملکول زیستی-تشخیصی پوشاننده سطح نانوذرات آهن برای به دام انداختن پاتوژن هدف استفاده می­کنند. علاوه بر این پپتیدها، امروزه برای جداسازی به روش ایمنی مغناطیسی از Immunomagnetic Dynabeads نیز استفاده می­شود؛ در این روش پاتوژن هدف با استفاده از نانوذرات آهن پوشیده شده با آنتی‌بادی‌های پلی‌کلونال خرگوشی ضد پاتوژن هدف و IgG ضد خرگوش بز (BioMag)، شناسایی می­شود.جداسازی مغناطیسی به روش آریاآزمای آویسا:روش نوین سنتز نانوذرات ایمونومگنت که طی تحقیقات پیشرفته و مداوم در آزمایشگاه­های شرکت آریاآزمای­آویسا بهینه شده است؛ ضمن استفاده از پلی­کلونال آنتی­بادی ضد پاتوژن هدف برای به دام انداختن آن، از ترکیباتی پوششی نوینی نیز بهره برده است که سبب می­شود، اتصالات غیراختصاصی از هر دو نوع به حداقل برسد.در حالی که به طور معمول، امروزه از اتصال­دهنده­های EDC-NHS برای پوشاندن مولکول­های زیستی­-تشخیصی روی سطح نانوذرات آهن بهره­می­برند؛ در روش نوین آریاآزمای آویسا برای سنتز نانوذرات ایمونومگنت از اتصال­دهنده­های شیمیایی­ای استفاده می­شود که پایداری بیشتری برای نانوذرات ایمونومگنت فراهم نموده و میل اتصال مولکول زیستی-تشخیصی را به نانوذرات آهن در مقایسه با روش­های موجود افزایش می­دهد.به کار گرفتن پلی­کلونال آنتی­بادی از طرفی موجب کاهش چشم­گیر هزینه­ی سنتز نانوذرات ایمونومگنت می­شود و از دیگر سو به دلیل اینکه تمامی اپی­تاپ­های سطحی پاتوژن موردنظر را هدف قرار می­دهد، باعث ایجاد کارایی مناسبی در به دام انداختن پاتوژن هدف می­گردد.همه­ی این­ها در حالی صورت پذیرفته است که طی این روش ابداعی، به دلیل استفاده از ترکیبات شیمیایی بلاک­کننده با کفایت امکان اتصال پاتوژن­های غیرهدف به سطح نانوذرات پارامغناطیس به حداقل رسیده است و همچنین مجاورسازی آنتی­بادی­های پلی­کلونال تخلیص شده با پاتوژن­های مشابه به هدف، احتمال واکنش متقاطع را به میزان زیادی کاهش داده است.تصویر میکروسکوپ الکترونی از نانوذرات ایمونومگنتDr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویDr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویSat, 21 Dec 2019 16:43:39 +0330https://virgool.ir/@dr_khosravim/واکنش-آگلوتیناسیونagglutination-bhpmrac5uzfd●آزمایش لاتکس آگلوتیناسیون یکی از روش هاي آزمایشگاهی برای بررسی وجود آنتی بادی اختصاصی یا آنتی ژن در نمونه هاي مختلف شامل بزاق، ادرار، مایع مغزی-نخاعی و خون می باشد.●نمونه های مورد نظر با دانه های لاتکسی که به آنتی بادی اختصاصی و یا آنتی ژن متصل شده اند، مخلوط می شوند که در صورت وجود ماده مورد نظر دانه های لاتکس کنار هم جمع می شوند (آگلوتینه می شوند).●این آزمایش برای بررسی وجود و ردیابی بسیاری از میکروارگانسیم های عفونت زا و مولکول های زیستی طراحی و انجام می شود.●نتیجه آزمایش لاتکس آگلوتیناسیون معمولا حدود 1 تا 4 دقیقه مشخص می شود. این تست برای تشخیص عفونت های میکروبی، باکتریایی، ویروسی، بیماری های خود ایمن، هورمون ها، داروها و پروتئین های سرم طراحی شده است، و کیت های تشخیصی آن ها توسط شرکت های زیادی در سراسر دنیا تولید شده اند. به عنوان مثال می توان به کیت تشخیص هپاتیتB، بیماری منژیت و ویروس های آنفولانزا اشاره کرد. اساس شناسایی با این روش واکنش بین آنتی بادی و آنتی ژن می باشد که در غلظت مناسب آن ها تجمع آنتي ژن و آنتي بادي رخ مي دهد و قابل مشاهده می شود.●ذرات لاتکس:فرآیندی که برای تولید ذرات لاتکس انجام می شود پلیمریزه کردن در حالت امولسیون می باشد. در ابتدا استیرن (Styrene) با یک سورفاکتانت (sodium dodecyl sulfate) مخلوط می شود که باعث ایجاد تعداد بسیار زیادی از مسیل های امولسیون در یک قطر مشابه می شود. سپس پتاسیم پر سولفات به واكنش افزوده می شود که باعث آغاز پلیمریزاسیون می شود. زمانی که پروسه پلیمریزاسیون كامل شد زنجیره های پلی استیرن به شکل میسل مرتب می شوند. بخش هیدروکربنی زنجیره پلی استیرن به سمت مرکز مسیل است و پایانه آن که دارای یون های سولفات است در سطح خارجی مسیل و درتماس با مولکول های آب می باشد. سایر پلی کربن ها و مشتقات آن ها نیز برای ساخت ذرات لاتکس مورد استفاده قرار می گیرد به عنوان مثال استیرن-دی ای ونیل بنزن، پلی متیل متاکریلیت، استیرن ونیل تولوئن، پلی ونیل تولوئن و....فرآیند تولید ذرات لاتکس از تولید رزین (Rubber)که یک امولسیون با ظاهری شیری می باشد نشات می گیرد و اصلاح لاتکس به آن داده شده است. با بهینه سازی فرآیند اماده سازی تولید ذرات لاتکس، هیدروکربن ها، سورفاکتانت ها و آغازگر میتوان قطر مطلوب ذرات لاتکس را بدست آورد.قطر ذرات لاتکس بین 0/05 میکرون تا 2 میکرون می باشند. همچنین به دلیل وجود یون های سولفات روی سطح ذرات لاتکس باعث ایجاد بار منفی ذاتی در این ذرات می شود.سطح ذرات لاتکس را میتوان با مواد مختلف اتصال داد و عملکرد آن ها را بهبود بخشید مواردی مانند آمیدی کردن، آمینی کردن، کربوکسیله کردن و هیدروکلسیه کردن کردن انجام می شود. همچنین امروزه لاتکس های رنگی برای تشخیص بهتر واکنش آگلوتیناسیون تولید می شوند.●ساخت کیت لاتکس آگلوتیناسیون:ذرات لاتکس به آنتی بادی و یا آنتی ژن های اختصاصی به صورت كوالان و يا غير كوالان متصل می شوند و سپس در برخورد با نمونه های مورد هدف در صورت ايجاد واکنش بین آنتی بادی و آنتی ژن،ذرات آگلوتینه تشكيل می شوند.●مزایا و معایب روش تشخیصی لاتکس آگلوتیناسیون:مزایا:1- امکان آزمایش نيمه کمی و تعیین تیتر آنتی بادی یا آنتی ژن مورد نظر2- هزینه کم این آزمون نسبت به سایر آزمایش های تشخیصی3- این آزمایش در زمانی کوتاه قابل انجام استمعایب:1- مشکل در تفسیر موارد با نتايج مرزی 2- اثرگذاري موارد مداخله کننده در نتایج3- حساسيت اندك آزمون در اغلب مواردDr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویDr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویSat, 14 Dec 2019 01:29:58 +0330https://virgool.ir/@dr_khosravim/کاربرد-ژل-آگارز-lyqbmrshkh4oژل الکتروفرز محصول PCRآگارز (Agarose) یک پلیمر پلی ساکاریدی می باشد که معمولا از برخی جلبک دریایی قرمز استخراج می‌شود.آگارز از تکرار واحد های آگاروبیوز تشکیل شده و یک پلیمر خطی را ایجاد می کنند. آگاروبیوز یک دی ساکارید می باشد که از D-گالاکتوز و 3,6-anhydro-L-galactopyranose تشکیل شده است.آگارز یکی از دو واحد اصلی آگار است و با حذف آگاروپکتین از آگار استحراج می‌شود.ساختار آگارز:هر زنجیره آگارز حاوی حدود ۸۰۰ مولکول گالاکتوز است، پلیمر آگارز الیاف هلیکسی را تشکیل می دهد که به ساختار سوپر کویل با شعاع ۲۰ تا ۳۰ نانومتر متصل می‌شوند. این الیاف در صورتی که جامد باشند سفت و سخت هستند و منافذی با قطر های ۵۰ نانومتر تا ۲۰۰ نانومتر را تشکیل می‌دهند که میزان سختی ژل و همچنین اندازه قطر منافذ ژل به غلظت آگارز بستگی دارند. هر چه غلظت آگارز بیشتر شود اندازه قطر منافذ کمتر می شود. ساختار سه بعدی ژل با ایجاد پیوند های هیدروژنی ایجاد می شود که در صورت افزایش دما دوباره به حالت مایع برمی گردد.درجه ژلی شدن و درجه حرارت ذوب بستگی به نوع آگارز دارد. آگارزهای استاندارد مشتق شده از Gelidium دارای درجه حرارت ژلی شدن از ۳۴–۳۸ درجه سانتی گراد و دمای ذوب ۹۰–۹۵ درجه سانتی گراد است، در حالی که آنهایی که از Gracilaria گرفته شده‌است، درجه حرارت ژلی شدن ۴۰–۵۲ درجه سانتیگراد و دمای ذوب ۸۵–۹۰ درجه سانتیگراد دارد. این موارد برای ژل یک درصد آگارز در نظر گرفته شده است.آگارز طبیعی حاوی گروه‌های متیل بدون بار است، میزان متیلاسیون به‌طور مستقیم با دمای ژل شدن متناسب می باشد.اما باید در نظر گرفت که متیلاسیون مصنوعی اثر معکوس دارد، در نتیجه افزایش متیلاسیون باعث کاهش دمای ژل شدن می‌شود. امروزه انواع آگارزهای اصلاح شده شیمیایی با دمای مختلف ذوب و ژلی شدن از طریق تغییرات شیمیایی در دسترس هستند.کاربرد آگارز:امروزه از آگارز استفاده های متفاوتی در زیست شناسی می شود:1- ژل الکتروفورز برای جدا سازی مولکول های DNA2- استفاده از بید های آگارز در کروماتوگرافی به منظور تخلیص پروتئین ها3- برای جداسازی و شناسایی واکنش آنتی بادی آنتی ژن در روش های immunodiffusion، immunoelectrophoresis و immunocomplexes.4- آگارز به دلیل خلوص بهتر و کاهش دمای ذوب و ژلی شدن نسبت به آگار برای کشت برخی از میکرواورگانسیم ها جایگزین مناسب تری برای آگار می باشد.5- استفاده از آگارز به عنوان داربست در کشت سه بعدی سلول ها.6- استفاده از بستر آگارزی به جای آگاری برای تست سنجش حرکت و جنبش میکرواورگانیسم ها.ژل الکتروفرز محصول واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)Dr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویDr Mohammad Khosravi - دکتر محمد خسرویSun, 01 Dec 2019 15:16:35 +0330